如何實現光學超分辨（下）

簡體傳統

席鵬著

第六章 PALM/fPALM 你掌心的痣我總記得在哪里

其實自從上次寫完STORM，對于采用“開關-定位”這一族超分辨技術來說，已經沒有什么更新鮮的技術可寫了。但是這里有兩個幾乎在同一時間被發明的孿生兄弟，卻不得不提。先把兩篇文章的信息放上：

Eric Betzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych, Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, Harald F. Hess, “Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution”, Science 2006 Vol. 313 no. 5793 pp. 1642-1645 (Received for publication 13 March 2006. Accepted for publication 2 August 2006. Published Online August 10 2006)

Samuel T. Hess, T. P. K. Girirajan, and M. D. Mason, “Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy,” Biophysical Journal, vol. 91, no. 11, pp. 4258-4272, 2006. Submitted June 12, 2006, and accepted for publication August 28, 2006. Published 1 December 2006

很多事件都非常相似，但是沒有這么相似：這兩個技術，第一個叫PALM，第二個叫FPALM；發明人中，第二個發明人叫Hess，第一個的發明人之一、共同第一作者也叫Hess（如果把s掰直成l，那就是STED的發明人教主Hell，更亂了）；第一個投出時間在06年3月早春，第二個是在06年夏天6月。


Eric Betzig	Harald Hess	Samuel Hess

先說Eric Betzig，我是很有幸讀到他的那篇2006年的Science論文，發現他竟然和我同在美國密西根州蘭欣市。然后在組會上給大家介紹他的工作，我老板也很驚訝：“哦，是他啊？原來做近場光學的，早幾年我們還一起吃過飯、討論過關于光學成像的相關問題。后來他自己出去開公司了，就沒了聯系。沒想到他竟然去了HHMI。”

于是我就很得意地暢想，或許，我們曾經在同一條河里釣過bash，只不過不在同一個時空而已。甚至，有可能從他鉤下逃脫的小魚，剛好在另一個時域被我撈起。蘭欣能釣魚的地方并不多。

Eric Betzig，一個典型的高帥富的奮斗故事。以下故事部分來源于HHMI的個人介紹，和2008年Nature Photonics的編輯采訪：

Eric本科畢業于Caltech，在康奈爾大學獲得博士學位。之后進入貝爾實驗室，在那里的六年中，他研究近場光學（上篇帖子里有讀者希望我再寫一點perfect lens的超分辨，其中就有很多是近場光學倏逝波的探測）并將其用于生物細胞成像。他注冊了一家公司叫New Millennium Research，但是很快就得到父親的召喚，去管理他們的加工業帝國。要知道，在汽車工業興盛的密西根州，加工業的地位舉足輕重。

在那里，有一個困擾著加工業多年的問題，也許因為它太難，所以大家對它習以為常，熟視無睹：為了加工一個小部件，必須讓一個很大很重的部件移動或停止。這樣，很多的時間和能量消耗在了移動加工工具上。Eric巧妙地讓加工機械高速移動，卻不犧牲加工精度。因此極大地提升了加工效率。

但是，燕雀安知鴻皓之志。在無數個深夜，Eric在夢里都回到了他熟悉的顯微鏡前，那里，一個個細胞在游動，神秘的生命信號在傳遞。然而，模糊的雙眼無法看清這一切。。。他驚醒了！因為他想到了應該怎么做就能看到這一切的神奇。

然而Eric也是一個十分現實的人：在申請職位的時候，他的簡歷上，有十年之久是學術空白。“要想讓這個世界再聽你的理論，你必須拿出一些讓人折服的好東西。”Eric說。

可是，他老爹似乎并不是非常支持兒子離開家族企業。Eric在到HHMI之前，沒有自己的實驗室。其實要想留住兒子，劃出30平米的小房子做個實驗室，應該不是難事。

Eric他們所有的實驗都因陋就簡，大部分是在他的好朋友，Harold Hess在加州的的公寓改裝的實驗室完成的。在那里，他們把光學平臺放在客廳里，鼓搗他們的新型顯微系統。可能我們讀者里面，很多人的實驗室硬件條件比他們更好。

Hess承認，自己與Betzig對生物學的認識都不深。但是他們堅信，生物學的發展能夠為超分辨帶來轉機。于是，他們屢敗屢戰了15年，希望能運用生物學知識獲取高分辨率的顯微圖像。當Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年發明的光敏綠色熒光蛋白（photoactivatable green fluorescent protein）后，他們知道他們已經找到了解決問題的關鍵所在：開關-定位。

接下來的整個冬天，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那間狹小的沒有取暖設備的實驗室里工作。

三個人，一個團隊。沒有漫長的圣誕假期，沒有奢侈的實驗裝備，有的，只是一個共同的信念支持著他們前行：既然理論上可行，那就不要借口。我們一定要在實驗上證明它！

冬去春來的時節，他們終于看到了轉機。回想起當時的情形，Lippincott-Schwartz指出：“他們當時非常激動。我還記得當我們得到第一張顯微圖像時，你根本無法看出那是什么東西。直到我看到他們將熒光圖像和電鏡圖像疊加之后的結果才相信，我們成功了。我當時覺得這一切真是太神奇了。”

2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小組在《科學》雜志上發表了他們的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到細胞黏著斑和特定細胞器內的蛋白質。整個出版過程：3月13號投稿，8月2號接收，10號網上發表。

PALM用于觀察溶酶體跨膜蛋白。

再來說說FPALM的故事。Samuel T Hess，分別在耶魯大學和康奈爾大學完成本科和博士學位；當時在Maine大學担任助理教授。在那兒他申請了一個課題，很快要結題了，所以有些經費要趕緊花掉（美帝也有類似制度）。但是Samuel并沒有隨便買些家當，而是沉迷于和學校的化學工程師和生物學工程師的一些討論：如何提高觀察活體細胞脂筏結構的分辨率？

2005年的一個夏夜，Hess被一陣電子打擊樂吵醒。鄰居家又在舉辦舞會了。無奈啊，愛好宴樂的蕓蕓眾生，哪知道我等科研工作者都是不眠不休的怪物呢？半睡半醒的Hess走下樓來，本想出去告訴他們安靜些，但是礙于情面（看過《生活大爆炸》的讀者大概都知道，我們科學家是多么不擅長這個的），只好作罷。他隨手畫了一副設計圖，可以通過借助熒光標記的蛋白質來顯示細胞形態。

所以，我經常教育我的學生：當你思路不清楚的時候，畫圖！

第二天早上，當Hess重新翻看這幅非清醒狀態繪制的潦草的設計圖時，不由得大笑起來：它是那么簡潔，但解決了“看不清”的難題。不可能吧？再看看，令人吃驚的是，這幅設計圖竟然沒有未被任何物理原理。于是他將信將疑地把這幅圖拿給物理系的同事peer review，也沒有發現任何問題。

接下來，Hess就按照他的設計圖開始制作顯微鏡了。此時，他的科研經費所剩不多，而結題時間轉眼就到。因此，Hess等人以最快的速度組裝好顯微鏡，并進行了試驗。同時，在不到兩天的時間里，緬因州立大學表面科學技術實驗室的同事就為Hess制備好供檢驗顯微鏡效果的藍寶石晶體樣品。所以，有一個高效的合作團隊至關重要。

相比與Eric等人的效率，Samuel還是相對有點慢了：從2005年有了想法、做了實驗到2006年6月文章投出，他用了一年時間。這個幾乎直接導致了他的工作的影響因子比Eric他們差了一個數量級。同時，由于他作圖相對潦草——未能在生物細胞上演示這一工具的強大魅力，也直接導致了他的工作相對不大受到關注。

2006年底，《生物物理學期刊》（Biophysical Journal）刊登了Hess小組的科研成果。2007年，Hess小組證明了FPALM可以分辨細胞膜脂筏上的蛋白質簇。

回到我們本章的標題。PALM/FPALM，突然想起了林憶蓮的《至少還有你》：

如果全世界我也可以忘記

至少還有你

值得我去珍惜

你掌心的痣

我總記得在哪里。

在《圣經—新約》里，耶穌第二次來到門徒中間，門徒們認不出已經變了身的救主。于是耶穌將手讓門徒看。當門徒們看到那釘痕，立刻就分辨了出來，就歡呼：“是主！”從此，幾個沒有受過教育的村夫，幾個已經嚇破膽準備散伙的門徒，重新團結起來，將耶穌的思想傳遍了世界，影響著我們今天的主要生活。

PALM，也正是因為在手掌（衍射極限分辨決定的區域內）范圍內通過蛋白質開-關的效應，因為只有一個釘痕，所以就能夠通過定位將其分辨出來了。

在寫完本章的同時，很欣喜地知道，我們的超分辨文章發表在PLoS ONE上。看來科普有好報啊！這一工作是我國首次實驗報道STED超分辨，且在三種細胞器和RNA上均驗證了STED所帶來的分辨率提升。

由于PLoS玩的是paper2.0，也就是論文的影響不再是SCI因子說了算，而是讀者您說了算，期待大家注冊個賬號并給點掌聲！我們在那里互動一下吧！你的支持是我繼續寫下去的動力！

文章鏈接：

我國STED超分辨工作在PLoS ONE發表
科學網報道：研究實現STED超分辨率光學顯微成像

第七章 SSIM 疏影橫斜水清淺

2011年的FOM閉幕式上，會議主席Fred Brakenhoff很遺憾地通知大家，Mats Gustafsson教授不幸因癌癥逝世，享年51歲。
2012年的FOM的副主題，就是紀念這個偉人和他帶給這個世界的SSIM。

什么是SSIM？全名Saturated Structured Illumination Microscopy，飽和結構光照明顯微。在介紹SIM之前，可以給大家看一張非常典型的照片：

在椅子背上，你看到了什么？不規則的條紋，對不對？這種條紋，如果你把圖片放大，可以看到是由于椅子前后的網狀織物疊加而成。在科學上，大家將其稱為莫爾條紋。

由于織物的網格比較密不容易被看到（頻率高），莫爾條紋則比較粗容易被看到（頻率低），因此如果知道B的結構，和A+B所疊加的莫爾條紋，將不能探測的高頻轉化為能探測的低頻，就能夠反推出A所攜帶的精細結構信息。這就是SIM的精義。如下圖所示。

回顧另一種能夠帶來分辨率提升的、廣為人知的技術：共聚焦。共聚焦通過一個點照明，加一個針孔實現分辨率提升。準確地說，由于在分辨率這個事情上，鄰居總是給我們干擾，所以用一個針孔把鄰居的光噪聲給它擋上，就能夠將分辨率提升。

共聚焦通過阻擋接收實現分辨率提升，而SIM則是通過給照明光一個調制實現分辨率提升。

能提升多少？共聚焦是1.4倍，因為即使針孔小到只有一個點，根據光路可逆原理，這個點到了樣品上也有點擴展函數那么大，最終，共聚焦的點擴展函數就是激發光的點擴展乘以針孔點擴展。如果將SIM的結構調制通過共軛放在接收端，則SIM也是一個一維調制。進一步，通過從多個角度進行一維限制，可以最終得到二維的分辨率提升。目前，比較流行的是每隔120度進行一次。SIM可以提升2倍的分辨率。

如果想進一步提升分辨率，則需要更細的線條。而前面我們講過，用光學一次成像，所能得到的細線的粗細是受衍射極限限制的。解決的方案只有一個，那就是通過某一類的飽和機制，形成更細的線。這樣，再加上SIM提升的2倍，就能夠實現完全突破衍射極限的限制了。
發張SIM的圖片，給大家驚艷一下。

A wide-field microscopy image (left) and a superresolution structured illumination microscopy (SR-SIM) image (right) each shows actin (green) and tubulin (red) cytoskeleton in a primary chicken fibroblast. (http://www.photonics.com/Article.aspx?AID=47750)

寫到這里，我想很多人都會對超分辨顯微這一領域躍躍欲試了。但是，你可能會覺得，自己沒有相關的科研背景。有意思的是，Mats Gustafsson在他開始博士后研究時，并沒有正規的光學訓練。他之前是從事電子學的。他在接受采訪時說：“我的電學背景讓我對這個世界有一種獨到的認識----我看問題喜歡從頻域而不是空域。這是我成功的主要原因。”因此，如果你想從事一個你喜歡的行業，你的背景絕對不是問題。相反，不能下定決心、有了志向卻不努力，才是影響你成功的主因。

Mats在2005年就被診斷患有癌癥。但是他天性樂觀，對人友善，對科學卻有一種執著的追求。2009年在波蘭的FOM會議上，Mats做完plenary presentation后，（那個時侯他已經在這個領域赫赫有名了），有一個女士在路上向他問問題。他蹲在路邊從行李中拿出一個筆記本，認真地在上面畫示意圖進行解釋。

有一次一個科學編輯問他，是什么力量讓他如此癡醉于科研？他說：“想像一下，你所處的世界是一個填字游戲。你站在這個游戲中間。你會開始用想象力去填它，還是會熟視無睹？”他停了一下，又說，“我無法想象讓自己停下來不去填。這就是我為什么做科研的原因。”

Mats Gustafsson(1960-2011)。后面的籬笆是否讓你聯想到了SIM？

讓我們紀念Mats，不僅因為他在科研上給我們帶來了全新的方法造福人類，而且因為他的謙遜與執著，將照亮我們前行的路。

席鵬課題組文章鏈接：

我國STED超分辨工作在PLoS ONE發表

OE: 利用共聚焦實現DIC位相浮雕

第八章大結局：陰陽定乾坤

經過前面八章的描述，我想讀者已經對超分辨的各種方法有了一定的認識。各種方法和他們的名字，如同八仙過海一般，一個個涌現在我們眼前。

正如牛頓用三定律描述世界，愛因斯坦用相對論描述時空一般，去繁就簡，才是大道。

那么，可不可以將這些超分辨技術統一為一種描述？

答案是可以，那就是：陰陽。

《易傳·系辭上傳》說：“是故，易有太極，是生兩儀”。太極即為天地未開、混沌未分的狀態。也就是說，所謂的混沌，就是一種不能區分的狀態。為了有效地進行區分，才有了陰陽兩儀。結合現代技術，陰陽，就是兩種狀態，也就是我們熟悉的二進制的ON（開）和OFF（關）狀態。

反過來看看我們的超分辨技術。STED，通過區分一個點的自發輻射(on)和受激輻射(off)實現超分辨；SSIM，通過調制一系列平行的ON-OFF實現超分辨；PALM/STORM則是隨機地調制點的ON-OFF實現超分辨。

再來細看的話，STED和SSIM均是形成一個結構性的光調制來實現超分辨，不依賴于特定的熒光染料。而PALM/STORM則是通過特定染料的性質，通過光控制來實現ON-OFF。

這兩類各有優劣：STED需要依賴共聚焦系統，并在其上加一個環形受激輻射光，光路最為復雜，所需要的光功率也非常高，但不需要進行復雜的圖像后期處理；SIM則相對來說儀器比較簡單（從三個方向上探測莫爾條紋即可），所需功率也較低，但是如果進行SSIM（飽和成像）的話，則功率要求一樣很高，且需要進行圖像后期頻域處理；PALM/STORM則只需要將一個TIRF系統的入射光變為兩束，相對的實驗門檻低，且所需功率較小（受不同熒光蛋白的開關特性約束）；然而后期圖像處理需要逐點進行定位。

也許有人會說，這個領域既然已經如此成功，而且已經總結得如此透徹，是不是沒什么新東西可做了？

絕非如此！今年的七月Nature Methods又一次開始重點關注顯微領域，包括新的超分辨技術，以及傳統顯微與生物信息學的結合。